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      師姐喊你抄作業 | 非凡探秘qPCR 3大疑難問題!

      來源:賽默飛電子商務平臺

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      01

      目標模板濃度太低


      在qPCR 中體現為CT值偏大,復孔重復性不佳。





      可能的原因1


      基因表達豐度低

      優化建議:選擇高靈敏度、熒光信號強、更寬動態范圍的qPCR試劑對付低豐度模板;



      可能的原因2


      模板稀釋過度

      優化建議:提高模板濃度(濃縮),減少模板稀釋度(理論上每稀釋10倍,CT 值大 3.3);



      可能的原因3


      模板有降解

      優化建議:重新制備模板,注意選擇好的RNA純化Kit,避免RNA降解,優化逆轉錄條件。


      02

      擴增效率異常

      擴增效率偏離100%±10% 應考慮優化。Ct值出現太晚的潛在原因之一是擴增效率低,導致效率低的原因可能有




      可能的原因1


      反應條件未優化

      優化建議:可以在同一實驗中預設不同退火溫度,選擇Ct值較小且平臺期熒光強度高的那個溫度;



      可能的原因2


      存在PCR反應抑制劑

      優化建議:一般反應抑制劑多為模板帶入,可考慮重新制備模板或者稀釋模板從而降低抑制劑水平;選擇反應性能強健、更耐受抑制劑 的試劑有助于減少此類因素影響;



      可能的原因3


      模板擴增區域有復雜二級結構,高GC含量,影響擴增效率

      優化建議:同一目標設計多個擴增區域/避開二級結構復雜的區域;選擇性能強健耐受性高的預混液,都是可行的解決方法。


      03

      PCR產物過長影響擴增效率




      優化建議:


      縮短PCR產物長度,控制在100 bp-150 bp之內



      優化建議:


      嘗試標準的三步擴增提高擴增效率



      優化建議:


      加長延伸時間使得反應完全,以提高擴增產量


      04

      無Ct值




      可能的原因1


      循環數不夠

      優化建議:一般反應設置為40個,必要時可增加到45個循環;



      可能的原因2


      信號采集設置不當

      優化建議:兩步擴增一般將信號采集設置在退火延伸階段,三步擴增程序應當將信號采集設置在72℃延伸階段。探針法通常在退火結束時或延伸結束時采集信號。




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      01

      樣本重復性差






      優化建議:


      取材部位/處理方式/時間應嚴謹地保障一致;選擇穩定可靠的試劑盒進行樣本制備(如RNA純化盡量選離心柱,帶去除gDNA的)、提取后對RNA的完整度和純度進行檢驗,減少樣本質量重復性差。


      02

      技術重復性差

      分為復孔重復性差(復孔之間ΔCt<0.5就算重復性良好),不同次跑的板間重復性差。


      排查方向有以下——

      1

      模板濃度低容易出現復孔重復性差,若同時Ct值偏大,可嘗試提高模板量。條件允許的話,增加復孔數,棄掉偏差大的值也好辦法。

      2

      加樣誤差是同時影響孔間和板間重復性的常見原因。良好的操作習慣有助于提高實驗重復性,包括:定期校準加樣器能減少不同時期之間的加樣體積偏差;選擇預混液能減少加樣誤差影響孔間重復性;低吸附耗材能減少試劑掛壁;穩定的操作環境溫度,反應前充分混勻樣品和試劑和離心除氣泡避免影響讀數,都有助于減少孔間差異和板間差異。注意儀器上不同位置的孔溫度一致性也可能影響孔間一致性。

      3

      試劑的配液穩定性也值得重視。有時候,配置好的反應板不一定能馬上上機,等待時長難以確定,導致板間誤差過大——若預混液能保持足夠長時間的穩定性,可確定第一個檢測板的結果與一個檢測板的結果相匹配,同時還能提高工作流程的整體便利性。

      4

      試劑的批間一致性是影響重復性、實驗前后可比較性的重要因素。定量PCR反應體積很小且靈敏度高,不同批次試劑的痕量偏差都可能影響結果穩定。盡量選擇同一批次/批號的試劑,選擇信譽可靠、批間一致性高的產品,有助于提高實驗重復性和結果可比較性。


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      用SYBR Green可以通過測熔解曲線來分析確認反應產物特異性,熔解曲線是隨溫度升高DNA雙螺旋結構解開程度的曲線:單尖峰提示產物只有一種;多峰則提示有不止一個產物,比如引物二聚體或者非特異擴增。



      排查方向有以下——




      02

      非特異擴增






      排查特征:


      電泳檢測;雜峰Tm值在80℃之后,目標峰之后的多為非特異擴增;



      優化建議:


      引物設計特異性不好或者模板質量不佳(如含有基因組污染)都可能導致非特異擴增


      ——建議考慮重新設計引物或者重新制備模板(記得在RNA純化中用DNase處理降解gDNA)


      另外,非特異擴增也可能來自反應退火開始前各種非特異延伸,和“實驗室某個角落or空氣中的前任、前前任qPCR” DNA污染!帶有UDG和dUTP配方設計的預混液可一步消除掉這類非特異產物;再加上抗體暫時封閉酶活的熱啟動設計,既能防止退火前的非特異反應,又能在退火同時迅速釋放酶活,讓反應更快速高效率。


      Tips:


      1

      熔解曲線不理想還可嘗試兩步法,因為二步法擴增特異性高。

      2

      單峰Tm值在80℃之前考慮沒有模板的可能性

      3

      單峰不尖要考慮可能有大小接近的非特異擴增

      4

      Mg2+離子濃度超過3mM以上則易形成引物二聚體,選擇一管全包條件已優化的預混液就不用考慮


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      A

      兼顧高靈敏度和高特異性:

      保障檢測的特異性同時具有更小的Ct 值,低檢出限5拷貝

      B

      高強度熒光信號:

      更大的擴增曲線dRn值,更高的平臺期熒光信號

      C

      寬動態范圍

      可在跨6個對數級動態范圍內進行精準檢測,并確定可靠的線性

      D


      桌面穩定性高:

      配置好的qPCR反應體系可以在室溫下穩定保存72小時

      E

      批間一致性高:

      生產過程遵循ISO 9001質量管理體系,保障數據的穩定性和重復性

      F

      抗殘留污染:

      采用UDG和dUTP配方,杜絕殘留擴增產物污染造成的假陽性結果


      轉載于https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MjM5MDI4MDc5Mw%3D%3D&mid=2651665317&idx=1&sn=8408084708020b17825c0b76f88ecf49&scene=45#wechat_redirect

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